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[生物] ISO 10993-5实用指南:细胞毒性

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发表于 2020-11-21 01:07:25 | 显示全部楼层 |阅读模式

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ISO 10993
2 F- e# \& P/ e- Y* i4 B. ]0 i8 \$ c所有类型的医疗设备都需要细胞毒性测试,这是国际标准的关键要素。
3 L9 {: C" K; X, q: f3 r0 S% v( D" j) R) i+ X+ G/ F% q
编译为ISO 10993的国际标准以及基于10993-1的FDA蓝皮书备忘录(#G95-1),通过识别用于选择设备材料的几种测试类型,解决了确保设备生物相容性的关键问题。对于所有类型的设备都需要,细胞毒性测试包含在10993-5:“细胞毒性测试-体外方法”中。该标准提出了许多旨在评估医疗器械材料中提取物的急性不良生物影响的测试方法。在进行这些测试时,实验室技术人员使用营养培养基在烧瓶中培养通常来自商业供应商的小鼠或人类来源的哺乳动物细胞。(体外拉丁语指在“体外”或字面上“在玻璃中”进行细胞培养。)所涉及的实验室技术与用于培养细菌的技术非常相似。培养的哺乳动物细胞通过细胞分裂繁殖,可以继代培养产生多个大烧瓶细胞,用于评估材料。MD&DI关于ISO 10993的连续系列文章中的这篇文章概述了细胞毒性测试,并讨论了执行此类程序的好处。9 r6 g- D9 l, {, E
5 ~1 n/ S( d( S0 O  G
测试方法  [" y) y0 G- S3 C/ H1 b

! Z& X+ x) s( b: i9 H在标准的细胞毒性测试方法中,细胞单层在烧瓶中生长至接近汇合,然后通过液体提取物直接或间接暴露于测试或对照物品。在广泛使用的洗脱测试方法中,通过将测试和对照材料置于标准条件下(例如3 cm 2或0.2 g / ml的培养基在37°C下放置24小时。然后将获得的每种液体提取物应用于培养细胞单层,以替代已将细胞营养至此的培养基。以这种方式,为测试细胞提供新鲜的营养培养基,该培养基含有衍生自测试物品或对照的可提取物。然后将培养物送回37°C恒温箱,并在指定时间定期取出进行显微镜检查长达三天。观察细胞对受试物质和对照物质有无明显的毒性迹象(例如细胞成分大小或外观改变或构型破坏)(图1和2)。) x  r5 {1 c1 D8 r

- ?  M( r$ D6 k8 Z6 V1 z' x图1.融合良好的L929小鼠成纤维细胞单层(放大100倍),表现出细胞间的接触。这种外观表明洗脱测试方法中无细胞毒性(阴性)反应。! B+ f6 w( D" \) n: k- I3 ]
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4 l- q( W0 {5 C% ~+ n7 {图2. L929小鼠成纤维细胞(放大100倍),显示了洗脱测试方法中的阳性细胞毒性反应。细胞呈粒状,缺乏正常的细胞质空间。细胞之间的大量开放区域表明发生了广泛的细胞裂解(崩解)。
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或者,可将测试和对照物品的样品直接应用于覆盖有营养培养基的单层细胞,或应用于半固态的营养琼脂覆盖层,以使细胞免受与样品接触可能引起的任何物理影响。在随后的孵育期间,样品中的可提取物将迁移到营养培养基中或通过营养琼脂 覆盖到基础单元格。孵育后,根据样品下方和周围的细胞效应区域的存在或不存在来评估单层细胞(图3)。覆盖法和直接接触法的萃取条件比洗脱试验的萃取条件严格。但是,如果只有很少量的样品可用,或者仅需要评估材料的一个表面,则这些方法特别有用。
4 y) F0 X' R$ z8 u  r% l
% j7 O1 g: u$ i5 O( N$ X% k+ q4 I图3.琼脂扩散瓶,内含阳性对照样品。从材料向外延伸的变色表明样品的存在已导致细胞裂解,失去了掺入琼脂层的重要染色剂。% l9 c+ C! e* m9 A
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% u$ x' ~0 E) U+ N* V! j  s洗脱方法以及直接接触和覆盖方法在技术文献和美国药典中都有描述以及ISO 10993-5。尽管使用了另外两种方法,但是使用的频率比上面提到的技术要少得多,但足以引起人们的注意。在细胞生长抑制方法中,将盐提取物添加到细胞悬液中,并且通过在标准的孵育时间后测量细胞质量来确定对提取物细胞的抑制作用。在日本菌落形成试验中,将指定数量的细胞暴露于测试物品或对照的提取物中;然后,孵育后,对测试和对照样品的细胞集落进行计数。如果用测试物提取物形成的菌落少于阴性对照,则可以认为这是细胞毒性的证据。0 o+ f7 m  `, E( N8 a# a0 E
4 s0 R$ F, M& Z( I. q% B
细胞毒性试验的好处! f$ z7 e8 s- h* S- B  ~; X
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细胞毒性测试是一种快速,标准化,灵敏且廉价的方法,可用来确定一种材料是否包含大量对生物有害的可提取物。测试的高灵敏度是由于培养物中测试细胞的分离以及缺乏协助 体内细胞的保护机制所致。哺乳动物细胞培养基是优选的提取剂,因为它是一种能够提取广泛化学结构的生理溶液,而不仅仅是可溶于水的化学结构。可以将抗生素添加到培养基中,以消除可能存在于测试材料和对照样品中的微生物污染的潜在干扰。细胞毒性测试的结果与短期植入物研究相当相关。 但是,他们确实 不一定与旨在检查特定终点(例如致敏性)或使用在更严格条件下(例如,在121°C的盐水或棉籽油中)制备的提取物的其他生物相容性标准测试良好关联。
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7 F. Z6 f8 b- V4 G4 z3 X细胞毒性测试方法可用于筛选可能用于医疗设备的材料,因为它们可将反应性材料与非反应性材料分开,从而提供了材料生物相容性的预测证据。ISO 10993-1标准“测试选择指南”认为这些测试非常重要,以至于每种类型的医疗设备都应开具这些测试以及敏化和刺激性测试。细胞毒性测试方法还可用于批次之间的材料比较,确定潜在的替代材料是否等同于当前使用的替代材料,进行故障排除并探索制造工艺变化的重要性。
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结论
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: w* y; B) W  s. m0 s细胞毒性测试是确保医疗设备生物相容性的良好第一步。阴性结果表明,该物质不含有害的可萃取物,或它们的量不足以在分离细胞的夸大条件下引起急性影响。但是,凭其自身的优点当然不能证明材料可以被认为具有生物相容性,这仅仅是第一步。另一方面,阳性的细胞毒性试验结果可被视为一种预警信号,表明一种材料含有一种或多种可能具有临床重要性的可提取物质。在这种情况下,需要进一步研究以确定材料的用途。
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